1.Next-generation sequencing (NGS) bij de diagnose, de prognose en de detectie van residuele ziekte in acute myeloide leukemie (AML) - Peter Valk (Erasmus MC Rotterdam).

NGS wordt nu al bijna overal gebruikt voor de bepaling van het mutatieprofiel bij akute myeloide leukemie (AML). Meetbare Residuele Ziekte (MRD) testen met NGS, bij AML patiënten in eerste complete remissie (CR1), heeft predictieve waarde over het risico op herval zoals na allogene SCT. NGS om MRD te meten is dus zeer waardevol of zelfs essentieel, zowel bij de diagnostiek met bepaling van de prognose als bij de predictie tijdens de diverse behandelingstrajecten.

De implicatie van NGS bij diagnostiek en prognosticering werd ingesloten in de nieuwste European Leukemia Net (ELN) AML classificatie (Must read: Döhner et al - Blood 2022) en het klinisch belang werd recent ook door meerdere onderzoeksgroepen verder bevestigd.

Met NGS technologie werd vastgesteld dat de mutaties bij diagnose vaak persisteren tijdens CR, met een hoge VAF (Variant Allele Frequency- zie nota), passend bij het begrip van reeds lang voorafgaande Clonale Hematopoiese (CH). Dergelijke mutaties hebben een majeur impact op het vroeg relaps risico bij de jongere AML patiënten (<65j). Andere, zoals vooral de RAS signaalpad mutaties zijn echter vaak wel uitgeklaard bij CR. Als model geïllustreerd: mutaties bij diagnose zijn ofwel DTA-mutaties (zie verder), ofwel non-DTA-mutaties en enkel deze laatsten hebben een klinisch significante relatie met het relapse risico! Een afwijkende NGS van MRD in CR, gedefinieerd door deze non-DTA mutaties, vormt een independente predictieve factor voor relaps en lagere overleving, zowel voor als na een SCT (pat.<65j). Dit is niet zo bij de oudere patiëntengroep, boven 65j. Bij hen persisteren de mutaties geassocieerd aan CH trouwens ook vaak in CR! Dergelijke kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in mutaties tussen de verschillende leeftijdscategorieën, zowel bij diagnose als bij detectie in CR, wijzen op verschillen in hun ziektebiologie en ontogenese.

Via NGS MRD meting wordt ook de impact van de verschillen in consolidatiebehandelingen tussen jongere en oudere AML patiënten aangetoond. Voorgesteld als werkmodel : NGS MRD detectie in CR levert 2 groepen op. Groep 1 omvat deze met afwijkingen zonder gestegen risico op relaps: verworven mutaties zonder proliferatieve signatuur of voordeel of zgn. leukemie initiërende mutaties mét proliferatief voordeel en DNMT3a, TET2 of ASXL1 mutaties (dit zijn de DTA-mutaties). Bij groep 2 is dat relaps risico wel gestegen, met name bij transformerende mutaties en bij NPM1, FLT3, NRAS,KIT of RUNX1 mutaties. Specifiek overweegt FLT3-ITD mutatie MRD (met 'deep sequencing) op alle huidige prognostische factoren bij diagnose en zelfs ook op de prognostische waarde van MRD detectie met NGS van gemuteerd NPM1 (of met Multiparameter Flow Cytometrie - NGF). Deze vaststelling wordt zeer relevant in de behandeling van dergelijke patiënten dankzij de nieuwe FLT3-inhibitoren!

Residuele ziektedetectie in AML patiënten, door doelgerichte NGS (en Multiparameter Flow Cytometrie, Next-gen .Flow Cytometrie - NGF) brengt independente en majeure additieve prognostische en predictieve waarden bij!

Nota: 'VAF is the percentage of sequence reads observed matching a specific DNA variant divided by the overall coverage at that locus. Because NGS provides a near random sample, VAF is thus a surrogate measure of the proportion of DNA molecules in the original specimen carrying the variant)(significant detection level at >5%?'.

2. 'Optical Genome Mapping - OGM' bij hematologische maligniteiten - Barbara Dewaele (UZLeuven).

OGM is een beloftevol alternatief voor de standaard cytogenetische meetprocedures ('karyotyping, fluorescent in situ hybridisation, single nucleotide polymorphism array, reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification') en deze stelling werd reeds partieel gevalideerd bij ALL en recent ook bij AML. De methode omvat extractie van Ultra High Molecular Weight (UHMW) dsDNA, labeling op specifieke motieven, transfer naar CHIP met microkanalen, aflezing met validatie van het resultaat volgens algoritmes die de molecules aligniëren naar constructieve consensus genoom mapping en crossmapping tegen referentie profielen (whole genome plots or views) incl. copy number alterations (CNA) en structurele varianten (SV) (Must read: Lestringant et al - Genes, Chromosomes and Cancer 2021).

Met de focus op ALL (Pre-B/TALL), werd OGM verder gevalideerd tegen de klassieke methodologie, bij 27 patiënten. Een serie positieve conclusies konden getrokken worden. De resultaten waren informatief bij alle 27 patiënten en de detectie van submicroscopische abnormaliteiten concordeerde excellent met MLPA (zie nota) . Met karyotypering en FISH bleek ook een goede overeenkomst, met o.a. identificatie van alle recurrente translocaties zonder fout-positieven, maar verder ook met aanvulling bij falende karyotypering, met verfijning van breekpunten bij structurele aberraties, detectie van translocatiepartners (vb. van TCR), detectie van additionele fusies (waaronder potentiëel therapeutisch nuttige) en detectie van chromotrypsis. Dankzij OGM konden meer patiënten risico-geklasseerd worden en dit ook nog snel, met een resultaat binnen 1 tot 2 weken! Dit is zeker nuttig, ook in studieprotocollen dankzij snelle stratificatie. Minpunten werden echter ook vastgesteld. Zo bleek de ploidie niet steeds correct en werden kleine (sub)clonen niet opgepikt: de VAF werd ingeschat op 7.5%. Ook kunnen iso- of isodicentrische chromosomen verkeerd geïnterpreteerd worden. Translocaties van een specifiek type (vb. rob (15;21)) werden niet gevonden, terwijl deze een belangrijk predispositie effect hebben bij ALL met een iAMP21. Conventionele karyotypering blijft dus nodig om complexe gevallen op te lossen! Extensieve kennis van cytogenetica is nog steeds noodzakelijk. FISH, met name voor BCR::ABL1 blijft ook nodig. Verbeterpunten zijn tevens ook aan de orde om openstaande vragen te beantwoorden. De breekpunten zijn soms niet exact: als niet gebaseerd op sequencing, welke zijn dan de significante? Structurele aberraties komen voor in de algemene populatie: zijn dit louter polymorfismen of zijn ze toch pathogenetisch? Hoge aantallen aberraties bij complexe gevallen vragen ook welke meetmethode best klaarheid schenkt: OGM of karyotypering?

De nieuwe resultaten van OGM bij de AML diagnostiek leveren ook boeiende data op! Bij 15 AML patiënten werden alle typische recurrente abnormaliteiten gedetecteerd. Enkele voorbeelden zijn: typische t(9;11) (KMTA12A::MLL T3); t(10;11)(NUP98::HHEY); gevallen met complex karyotype met oa verlies van 5q in tris.8. Tevens werden additionele aberraties gevonden bij 6 gevallen: bijvoorbeeld een nieuw rearrangement van RUNX1, of t(18;16)(q22.2;q23.2) en nog andere.

Dat OGM andere methoden zoals PCR of FISH zal verdringen wordt niet onwaarschijnlijk! Ook worden we benieuwd wat er zal blijken bij andere hematologische maligniteiten zoals CLL of bij MDS!

Nota: MLPA 'Multiplex Litigation-dependent Probe Amplification': techniek gebruikt in de cytogenetica voor het aantonen van gen-amplificaties, van gen-verlies of hypermethylaties.

1.Next-generation sequencing (NGS) bij de diagnose, de prognose en de detectie van residuele ziekte in acute myeloide leukemie (AML) - Peter Valk (Erasmus MC Rotterdam).NGS wordt nu al bijna overal gebruikt voor de bepaling van het mutatieprofiel bij akute myeloide leukemie (AML). Meetbare Residuele Ziekte (MRD) testen met NGS, bij AML patiënten in eerste complete remissie (CR1), heeft predictieve waarde over het risico op herval zoals na allogene SCT. NGS om MRD te meten is dus zeer waardevol of zelfs essentieel, zowel bij de diagnostiek met bepaling van de prognose als bij de predictie tijdens de diverse behandelingstrajecten.De implicatie van NGS bij diagnostiek en prognosticering werd ingesloten in de nieuwste European Leukemia Net (ELN) AML classificatie (Must read: Döhner et al - Blood 2022) en het klinisch belang werd recent ook door meerdere onderzoeksgroepen verder bevestigd.Met NGS technologie werd vastgesteld dat de mutaties bij diagnose vaak persisteren tijdens CR, met een hoge VAF (Variant Allele Frequency- zie nota), passend bij het begrip van reeds lang voorafgaande Clonale Hematopoiese (CH). Dergelijke mutaties hebben een majeur impact op het vroeg relaps risico bij de jongere AML patiënten (<65j). Andere, zoals vooral de RAS signaalpad mutaties zijn echter vaak wel uitgeklaard bij CR. Als model geïllustreerd: mutaties bij diagnose zijn ofwel DTA-mutaties (zie verder), ofwel non-DTA-mutaties en enkel deze laatsten hebben een klinisch significante relatie met het relapse risico! Een afwijkende NGS van MRD in CR, gedefinieerd door deze non-DTA mutaties, vormt een independente predictieve factor voor relaps en lagere overleving, zowel voor als na een SCT (pat.<65j). Dit is niet zo bij de oudere patiëntengroep, boven 65j. Bij hen persisteren de mutaties geassocieerd aan CH trouwens ook vaak in CR! Dergelijke kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in mutaties tussen de verschillende leeftijdscategorieën, zowel bij diagnose als bij detectie in CR, wijzen op verschillen in hun ziektebiologie en ontogenese.Via NGS MRD meting wordt ook de impact van de verschillen in consolidatiebehandelingen tussen jongere en oudere AML patiënten aangetoond. Voorgesteld als werkmodel : NGS MRD detectie in CR levert 2 groepen op. Groep 1 omvat deze met afwijkingen zonder gestegen risico op relaps: verworven mutaties zonder proliferatieve signatuur of voordeel of zgn. leukemie initiërende mutaties mét proliferatief voordeel en DNMT3a, TET2 of ASXL1 mutaties (dit zijn de DTA-mutaties). Bij groep 2 is dat relaps risico wel gestegen, met name bij transformerende mutaties en bij NPM1, FLT3, NRAS,KIT of RUNX1 mutaties. Specifiek overweegt FLT3-ITD mutatie MRD (met 'deep sequencing) op alle huidige prognostische factoren bij diagnose en zelfs ook op de prognostische waarde van MRD detectie met NGS van gemuteerd NPM1 (of met Multiparameter Flow Cytometrie - NGF). Deze vaststelling wordt zeer relevant in de behandeling van dergelijke patiënten dankzij de nieuwe FLT3-inhibitoren!Residuele ziektedetectie in AML patiënten, door doelgerichte NGS (en Multiparameter Flow Cytometrie, Next-gen .Flow Cytometrie - NGF) brengt independente en majeure additieve prognostische en predictieve waarden bij! Nota: 'VAF is the percentage of sequence reads observed matching a specific DNA variant divided by the overall coverage at that locus. Because NGS provides a near random sample, VAF is thus a surrogate measure of the proportion of DNA molecules in the original specimen carrying the variant)(significant detection level at >5%?'.2. 'Optical Genome Mapping - OGM' bij hematologische maligniteiten - Barbara Dewaele (UZLeuven).OGM is een beloftevol alternatief voor de standaard cytogenetische meetprocedures ('karyotyping, fluorescent in situ hybridisation, single nucleotide polymorphism array, reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification') en deze stelling werd reeds partieel gevalideerd bij ALL en recent ook bij AML. De methode omvat extractie van Ultra High Molecular Weight (UHMW) dsDNA, labeling op specifieke motieven, transfer naar CHIP met microkanalen, aflezing met validatie van het resultaat volgens algoritmes die de molecules aligniëren naar constructieve consensus genoom mapping en crossmapping tegen referentie profielen (whole genome plots or views) incl. copy number alterations (CNA) en structurele varianten (SV) (Must read: Lestringant et al - Genes, Chromosomes and Cancer 2021).Met de focus op ALL (Pre-B/TALL), werd OGM verder gevalideerd tegen de klassieke methodologie, bij 27 patiënten. Een serie positieve conclusies konden getrokken worden. De resultaten waren informatief bij alle 27 patiënten en de detectie van submicroscopische abnormaliteiten concordeerde excellent met MLPA (zie nota) . Met karyotypering en FISH bleek ook een goede overeenkomst, met o.a. identificatie van alle recurrente translocaties zonder fout-positieven, maar verder ook met aanvulling bij falende karyotypering, met verfijning van breekpunten bij structurele aberraties, detectie van translocatiepartners (vb. van TCR), detectie van additionele fusies (waaronder potentiëel therapeutisch nuttige) en detectie van chromotrypsis. Dankzij OGM konden meer patiënten risico-geklasseerd worden en dit ook nog snel, met een resultaat binnen 1 tot 2 weken! Dit is zeker nuttig, ook in studieprotocollen dankzij snelle stratificatie. Minpunten werden echter ook vastgesteld. Zo bleek de ploidie niet steeds correct en werden kleine (sub)clonen niet opgepikt: de VAF werd ingeschat op 7.5%. Ook kunnen iso- of isodicentrische chromosomen verkeerd geïnterpreteerd worden. Translocaties van een specifiek type (vb. rob (15;21)) werden niet gevonden, terwijl deze een belangrijk predispositie effect hebben bij ALL met een iAMP21. Conventionele karyotypering blijft dus nodig om complexe gevallen op te lossen! Extensieve kennis van cytogenetica is nog steeds noodzakelijk. FISH, met name voor BCR::ABL1 blijft ook nodig. Verbeterpunten zijn tevens ook aan de orde om openstaande vragen te beantwoorden. De breekpunten zijn soms niet exact: als niet gebaseerd op sequencing, welke zijn dan de significante? Structurele aberraties komen voor in de algemene populatie: zijn dit louter polymorfismen of zijn ze toch pathogenetisch? Hoge aantallen aberraties bij complexe gevallen vragen ook welke meetmethode best klaarheid schenkt: OGM of karyotypering?De nieuwe resultaten van OGM bij de AML diagnostiek leveren ook boeiende data op! Bij 15 AML patiënten werden alle typische recurrente abnormaliteiten gedetecteerd. Enkele voorbeelden zijn: typische t(9;11) (KMTA12A::MLL T3); t(10;11)(NUP98::HHEY); gevallen met complex karyotype met oa verlies van 5q in tris.8. Tevens werden additionele aberraties gevonden bij 6 gevallen: bijvoorbeeld een nieuw rearrangement van RUNX1, of t(18;16)(q22.2;q23.2) en nog andere.Dat OGM andere methoden zoals PCR of FISH zal verdringen wordt niet onwaarschijnlijk! Ook worden we benieuwd wat er zal blijken bij andere hematologische maligniteiten zoals CLL of bij MDS! Nota: MLPA 'Multiplex Litigation-dependent Probe Amplification': techniek gebruikt in de cytogenetica voor het aantonen van gen-amplificaties, van gen-verlies of hypermethylaties.